生命科學(xué)與工程學(xué)院李英研究員團(tuán)隊(duì)在大熊貓腸道菌群研究中取得重要進(jìn)展

發(fā)表時(shí)間：2023-09-01

2023年8月14日，Microbiome（Top 一區(qū)，IF= 15.5）在線發(fā)表了題為“The unique gut microbiome of giant pandas involved in protein metabolism contributes to the host’s dietary adaption to bamboo”的學(xué)術(shù)論文。我校生命科學(xué)與工程學(xué)院鄧飛龍博士為本文的第一作者，我校為第一署名單位，中國(guó)國(guó)家大熊貓中心王承東、李德生正高級(jí)工程師為共同一作，我校李英研究員和美國(guó)阿肯色大學(xué)趙江潮教授為共同通訊作者。

Deng, F., Wang, C., Li, D. et al. The unique gut microbiome of giant pandas involved in protein metabolism contributes to the host’s dietary adaption to bamboo. Microbiome 11, 180 (2023). 原文鏈接：

大熊貓是全球野生動(dòng)物保護(hù)的旗艦物種。盡管大熊貓屬于食肉目動(dòng)物，并擁有典型的食肉類動(dòng)物的胃腸道特征，但其飲食主要由高纖維的竹子組成。大熊貓基因組缺乏消化纖維素和半纖維素所需的酶，因此研究人員普遍認(rèn)為腸道微生物對(duì)大熊貓食性變遷的適應(yīng)發(fā)揮了重要作用。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道微生物包含少量降解纖維食物/半纖維素的酶，但其含量顯著低于典型的草食動(dòng)物。因此，大熊貓腸道微生物對(duì)宿主食性改變的適應(yīng)性貢獻(xiàn)仍然有待深入探究。

本論文通過(guò)深度的illumina二代測(cè)序和三代測(cè)序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了較為完整的大熊貓腸道微生物基因組（MAGs）；利用宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，將大熊貓腸道微生物與肉食動(dòng)物、草食動(dòng)物和雜食動(dòng)物的消化道微生物進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道微生物的氨基酸代謝顯著區(qū)分于草食動(dòng)物；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)非解乳糖鏈球菌(Streptococcus alactolyticus)可能是大熊貓腸道微生物氨基酸代謝的關(guān)鍵微生物，小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)證明非解乳糖鏈球菌顯著提高小鼠空腸內(nèi)容物中必需氨基酸水平。

圖1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述示意圖

結(jié)果解讀

1、大熊貓腸道微生物宏基因組組裝基因組（MAGs）構(gòu)建

盡可能完整的重構(gòu)腸道微生物基因組對(duì)于研究腸道微生物功能，尤其是獨(dú)特的微生物和功能至關(guān)重要。本論文結(jié)合6.3T Illumina 二代宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)和0.3T Nanopore三代宏基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建出610個(gè)中高質(zhì)量的微生物基因組，非冗余基因組408個(gè)，高質(zhì)量基因組148個(gè)，平均覆蓋76.47%的宏基因組reads。主要以厚壁菌門 (204 MAGs, 50.00%) 、變形菌門 (139 MAGs, 34.07%), 擬桿菌門 (33 MAGs, 8.09%) and 和放線菌門(21 MAGs, 5.15%)為主。

圖2. 408個(gè)宏基因組組裝基因組(MAGs)的分類注釋和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2. 大熊貓腸道微生物宏轉(zhuǎn)錄組分析

既往研究基于宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)解析大熊貓腸道微生物功能，但是對(duì)微生物的表達(dá)情況知之甚少。論文利用14個(gè)圈養(yǎng)大熊貓糞便樣本，結(jié)合宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了大熊貓腸道微生物的表達(dá)活躍度。

在種水平，宏基因組數(shù)據(jù)顯示的大熊貓腸道微生物的優(yōu)勢(shì)種為E. flexneri，平均相對(duì)豐度為27.10%，其次是S. alactolyticus（24.34%）和E. coli（6.08%）。然而，通過(guò)宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)豐度最高的物種是S. alactolyticus，平均豐度為45.45%，其次是E. flexneri（10.49%）和Leuconostoc lactis A（3.66%）。值得注意的是，盡管根據(jù)宏基因組數(shù)據(jù)，E. coli是第3豐富的物種，但根據(jù)宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其平均豐度只有2.38%，排名第六。

圖3. 基于宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組的相對(duì)豐度（表達(dá)量）Top10物種

3、宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析為大熊貓營(yíng)養(yǎng)代謝基因表達(dá)概況提供了新的見(jiàn)解

課題研究了主要營(yíng)養(yǎng)物（例如，碳水化合物，氨基酸）代謝中的微生物代謝途徑，并基于宏基因組豐度和宏轉(zhuǎn)錄組表達(dá)與草食性（牛和羊）、雜食性（豬，老鼠和人）和肉食性（貓）進(jìn)行了比較。對(duì)27個(gè)纖維/半纖維/木質(zhì)素降解相關(guān)的基因家族的相對(duì)豐度和表達(dá)豐度比較，發(fā)現(xiàn)大熊貓中涉及植物細(xì)胞壁降解的微生物基因家族的代謝途徑與貓的更為相似。肉食動(dòng)物腸道中這些基因家族的相對(duì)豐度與草食動(dòng)物（ANOSIM，R=0.81，P=0.001）和雜食動(dòng)物（ANOSIM，R=0.93，P=0.001）（圖4A）顯著不同。而基于宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，也顯示出類似的模式，即肉食動(dòng)物顯著地與雜食動(dòng)物（ANOSIM，R=0.37，P=0.001）和草食動(dòng)物（ANOSIM，R=0.75，P=0.001）分離（圖4B）。包括endo-1,4-beta-xylanase (EC ), cellobiose phosphorylase (EC ), and endo-cellulase (EC ) 等關(guān)鍵酶在內(nèi)都與肉食動(dòng)物貓相似，低于草食動(dòng)物和雜食動(dòng)物，這表明大熊貓的腸道微生物不具備幫助宿主利用竹子纖維獲得額外能量的潛能。

圖4. 不同宿主種類腸道微生物組中膳食纖維代謝酶相關(guān)基因的組成與表達(dá)模式

既往研究表明，竹子中的蛋白質(zhì)可能是大熊貓的主要能量來(lái)源。因此，本課題分析了涉及氨基酸代謝的基因家族的豐度和表達(dá)，包括61個(gè)編碼氨基酸降解酶的基因家族和98個(gè)涉及氨基酸合成的基因家族。基于宏基因組數(shù)據(jù)中的基因豐度的Beta多樣性（Bray-Curtis）顯示，不同的宿主物種在涉及氨基酸降解的基因上有顯著的差異（ANOSIM，P≤0.05）（圖5A）。肉食動(dòng)物（大熊貓和貓）與雜食動(dòng)物（R=0.616，P=0.001）和草食動(dòng)物（R=0.576，P=0.001）差異顯著，而雜食動(dòng)物和草食動(dòng)物差異顯著但R值較低（R=0.203，P=0.002）。在氨基酸生物合成方面，基于宏基因組（圖5C）和宏轉(zhuǎn)錄組（圖5D）數(shù)據(jù)集的PCoA圖上，大熊貓與其他宿主物種顯著不同（P<0.01）。

圖5. 不同宿主物種腸道微生物組中涉及氨基酸代謝的基因的豐度和表達(dá)模式

4. 大熊貓腸道微生物的必需氨基酸合成

植物蛋白往往缺乏某些動(dòng)物所需的必需氨基酸，為了探索腸道微生物是否幫助宿主合成必需氨基酸，本研究分析了 S. alactolyticus（大熊貓腸道中表達(dá)活躍度最高的微生物）中涉及必需氨基酸生物合成的基因的豐度。根據(jù)S. alactolyticus的相對(duì)豐度（RA）對(duì)圈養(yǎng)大熊貓重新分組為三組：高豐度組[RA ≥?50%，n =?28]，中豐度組(50% >?RA?≥?25%，n =?29)和低豐度組(RA <?25%，n =?33)，比較分析顯示，高豐度組的map00300 KEGG途徑(圖6A)和map00400 KEGG途徑(圖6B)的豐度顯著高于中等(map00300: P =?0.027, map00400: P?=?0.0056)和低豐度組(map00300: P =?0.0049, map00400: P?=?0.0014)組。對(duì)于map00290 KEGG途徑(圖6C)，其在高組的豐度顯著高于中等組(P =?0.040)，高豐度組與低豐度組之間差異不顯著。結(jié)果顯示S. alactolyticus可能對(duì)大熊貓氨基酸合成有重要的貢獻(xiàn)。

圖6. 在不同S. alactolyticus相對(duì)豐度必需氨基酸生物合成的KEGG途徑的相對(duì)豐度差異

為了驗(yàn)證非解乳糖鏈球菌（S. alactolyticus）在腸道中合成必需氨基酸的作用，首先從大熊貓中分離出S. alactolyticus，然后灌胃給低蛋白和正常蛋白日糧的BALB/c小鼠。灌胃結(jié)束后3周取空腸內(nèi)容測(cè)定代謝組。結(jié)果表明，對(duì)于低蛋白飲食的小鼠，灌胃組的非必需氨基酸（8.64 ×?10¹⁰ vs. 9.89?×?10¹⁰, P?=?0.034）和必需氨基酸（3.71 ×?10¹⁰ vs. 4.83?×?10¹⁰, P?=?0.042）的總豐度均顯著高對(duì)照組。而正常日糧下，灌胃組的非必需氨基酸（8.01 ×?10¹⁰  vs. 8.72?×?10¹⁰, P?=?0.21）和必需氨基酸（3.37 ×?10¹⁰ vs. 3.99?×?10¹⁰, P?=?0.087）豐度更高，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于特定的氨基酸種類，在低蛋白日糧下，纈氨酸（P =?0.039）和酪氨酸（P =?0.027）在灌胃組中的豐度顯著更高；而當(dāng)給予正常蛋白飲食時(shí)，谷氨酸（P =?0.033）在灌胃組中顯著增加。

圖7. 不同處理組小鼠氨基酸豐度比較

本研究重建了總共408個(gè)非冗余的宏基因組組裝基因組（MAG），發(fā)現(xiàn)大熊貓的腸道微生物群在蛋白質(zhì)代謝而非碳水化合物代謝中起到了重要作用。進(jìn)一步證明非解乳糖鏈球菌（S. alactolyticus）作為大熊貓腸道微生物最豐富的細(xì)菌種類，參與了大熊貓腸道的蛋白質(zhì)代謝。本項(xiàng)研究為提高我們對(duì)大熊貓腸道微生物多樣性和代謝潛力的認(rèn)識(shí)提供了基礎(chǔ)，從微生物氨基酸代謝的角度解釋大熊貓腸道微生物對(duì)大熊貓食性轉(zhuǎn)變的作用，為我們解析大熊貓的適應(yīng)性進(jìn)化提供了一個(gè)新的視角。李英課題組近10年以來(lái)，對(duì)大熊貓腸道菌群的組成、潛在功能、對(duì)宿主適應(yīng)竹子的作用及其在大熊貓野化訓(xùn)練及遷地保護(hù)中的潛在影響進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，成果在Molecular Ecology，Frontiers in Microbiology等期刊發(fā)表SCI論文10余篇。

（生命科學(xué)與工程學(xué)院）